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　　2005年美國食品藥品管理局(USFDA)指出，在醫藥行業使用TOC方法來檢測清潔過程后的殘留物是可行的。然而自1993年開始，制藥行業一直以來都使用產品專屬性方法(HPLC，ELISA)來檢測殘留物，所以如何使用TOC方法建立一個完整簡便的清潔驗證規程呢?制藥行業的小伙伴們，也許都想要對TOC法有一個系統深入的了解。

　　中國2010年新版GMP要求所有制藥企業需要對生產設備進行清潔驗證，總有機碳TOC (Total Organic Carbon)分析是非常適用于清潔驗證的分析方法。與傳統的HPLC方法相比較，TOC法的靈敏度更高，對于少數不溶于水的有機化合物也能檢測到。而且驗證過程簡單方便，無需設置其他參數。

　　驗證概述

　　中藥提取車間、中藥制劑車間，以及共線生產多個品種的生產設備，為了大限度降低藥品生產過程中污染及交叉污染等風險，根據GMP(2010年版)的要求，必須要制定共線生產設備清洗驗證方案。由此可見清潔驗證的重要性。

　　對容易擦拭且表面平整的設備，采用棉簽擦拭法;對不易擦拭取樣的設備及管路，采用淋洗法。根據設備的具體情況，確定可操作的清洗方法，要根據不同的清洗方法，通過測定微生物限度和總有機碳確定殘留污染物的限度。

　　設備清洗使用擦拭法進行清洗驗證的，相應的殘留物檢查，使用棉簽擦拭法進行采集檢查試樣，加總有機碳檢查用水溶解稀釋后測定總有機碳;設備清洗使用淋洗法進行清洗驗證的，相應的殘留物檢查，采集淋洗液作為檢查試樣測定總有機碳。

　　通過驗證該分析方法的系統適用性、線性、度、重復性，確認該方法適合于設備清洗驗證的檢測要求，取樣回收率驗證取樣方法的有效性。

　　驗證目的

　　通過TOC法的驗證，確保該方法能夠可靠地檢測出共線生產設備清洗后的殘留的污染物，能夠符合預期的限度標準。這是每一位制藥行業的同仁都需要注意的。

　　驗證范圍

　　適用于中藥提取車間、中藥制劑車間等共線生產相關設備清洗后，采集樣品的TOC測定方法的驗證。

　　所以，TOC方法進行清潔驗證，在醫藥和生物制藥行業里，到底應該怎樣定義呢?

　　◆ 根據清潔過程而非產品簡化驗證方法;

　　◆ 快速評估清潔過程的清潔能力;

　　◆ 通過擦拭和淋洗取樣法，優化關鍵清潔參數(TACT，即溫度、動作、濃度與時間);

　　◆ 估量壞的情形以及成分復雜的化合物，例如清潔劑;

　　◆ 加快產品更換速度，更好地按計劃生產。

　　TOC法的*優勢

　　對于TOC法來說，將有機物設為專屬物質時，無論其來源是產品、清潔劑、化學品、溶劑，還是副產物及微生物污染，要判斷出任何殘留物質是否存在，都能夠地很好完成這一任務。只要其分子結構中包含碳，就能夠檢測出任何的活性制藥成分或者清潔用的殘留物質。而檢測結果必須低于目標化合物物的限度，提高了清潔驗證的嚴格性。

　　TOC法已經逐漸被制藥行業所接受，整個行業的清潔驗證的嚴格性得到了顯著提高，也越來越符合行業的整體要求。TOC法的普適性，為制藥企業節省了時間和人力成本。科學、合理、可行的清潔驗證過程，確保了藥品安全生產所需要的清潔度。

　　TOC法學習筆記

　　*章　TOC基礎知識

　　一、什么是TOC?

　　二、為什么在清潔驗證和常規的清潔監測中使用TOC?

　　三、清潔驗證中的TOC的應用

　　四、何時可使用TOC測定

　　五、TOC法與常用分析方法的比較

　　第二章　HPLC與TOC方法的對比

　　此處特別針對HPLC與TOC進行一下講解：

　　一、TOC與HPLC法的比較

　　二、HPLC法的局限性

　　三、TOC替代HPLC

　　四、TOC法的優勢

　　五、TOC來檢測法規上的支持

　　第三章TOC分析方法的驗證

　　一、分析方法驗證的要求

　　二、TOC分析方法驗證的前提：TOC分析儀的性能確認

　　三、系統適用性試驗

　　四、分析方法驗證的要點

　　五、TOC方法驗證的具體內容

　　➤專屬性

　　➤線性和范圍

　　➤精密度和度

　　➤回收率試驗

　　Ø 取樣方法

　　Ø 擦拭法回收率

　　Ø 擦拭技術

　　Ø 淋洗法回收率

　　Ø 回收率接受程度

　　➤低檢測限(LOD)、低定量限(LOQ)

　　六、TOC分析方法的注意點

　　*章TOC基礎知識

　　一、什么是TOC?

　　TOC方法檢測的原理：

　　總有機碳(TOC)，由專門的儀器——總有機碳分析儀(以下簡稱TOC分析儀)來測定。TOC分析儀，是將水溶液中的總有機碳氧化為二氧化碳，并且測定其含量。利用二氧化碳與總有機碳之間碳含量的對應關系，從而對水溶液中總有機碳進行定量測定。

　　TOC法包括碳的氧化和檢測生成的二氧化碳兩個過程。現有多種氧化技術，包括光觸酶氧化、化學氧化及高溫灼燒等。

　　二、為什么在清潔驗證和常規的清潔監測中使用TOC?

　　許多藥品制造場所目前已經使用TOC作為CV和監測

　　➤非專屬性的方法，在理論上能探測到所有含有有機碳的殘留分子，容易驗證。

　　➤通用的樣品分析方法：清潔驗證和確認，原材料和工廠用水

　　➤能分析很大范圍的溶解，“不溶”及絕大部分制藥廠工業中的常見化合物

　　➤TOC能探測到設備中意外未*清潔的有機雜技和殘留物。

　　➤很高很好的費用節省。簡單的驗證方法，易于培訓新使用者。

　　➤提高設備周轉時間。

　　三、清潔驗證中的TOC的應用

　　➤測定清潔劑的殘量

　　➤與特定分析相結合來測定藥的成份

　　➤為建立清潔程序﹐TOC被用作清潔度的一般指示

　　➤測定活性成份

　　四、何時可使用TOC測定

　　➤取決于殘留物的類型 (清潔劑，活性成份，賦形劑)

　　➤被測物是否是水溶性的?

　　➤被測物是否含有碳?

　　TOC非專屬性方法，TOC測定的是非確定物

　　➤TOC 方法可測定樣品中的所有易氧化碳含量

　　➤TOC 方法只適用于水溶液樣品

　　➤測定結果的單位用 ppb (ug碳/L) 和 ppm (mg碳/L) 來表示

　　Q：此處存在疑問，如果是酯溶性產品能否使用TOC法進行清潔驗證的檢測?

　　A：通過查找文獻和查閱相關材料，TOC可以檢測到在水中溶解度很低的有機物，而且度還可以。

　　五、TOC法與常用分析方法的比較

　　➤TOC法與HPLC法和UV/Vis分光光度法不同，屬于非專屬性方法，是檢測所有含碳化合物，包括活性組分、輔料和清潔劑的方法。

　　➤TOC法的靈敏度可達億分之一，而且與 HPLC法和UV/Vis分光光度法相比.具有不需摸索活性成分的檢測方法和考慮樣品的因素，較為省時等優點

　　方法

　　專屬

　　藥殘量

　　賦形劑

　　清潔劑

　　生物制品

　　HPLC

　　是

　　是

　　是

　　是

　　TLC

　　是

　　是

　　是

　　TOC

　　否

　　是

　　是

　　是

　　是

　　光譜

　　是

　　是

　　是

　　是

　　PH

　　否

　　是

　　電導率

　　否

　　是

　　Source: K.M.Jenkens, A.J. Vandervielen, Pharmaceutical Technology, April 1994

　　TOC = 活性物 + 賦形劑 + 清潔劑 + 水系統中的有機物

　　第二章　HPLC與TOC方法的對比

　　此處特別針對HPLC與TOC進行一下講解：

　　一、TOC與HPLC法的比較

　　HPLC方法

　　TOC方法

　　l對每一種有機化合物都有特別針對性

　　lHPLC方法需要每一個單一的實驗過程

　　l靈敏度(受制于檢測器和化合物)

　　l可以檢測不溶于水的物質

　　l*的方法，應用廣泛

　　l針對性是對所有的有機物，因為所有的有機物都被氧化

　　l一個TOC方法對付所有的實驗過程，無需設置其他參數

　　l靈敏度高(1ppb C)

　　l少數不溶于水的有機化合物也能被檢測到

　　l已被制造業的清潔驗證所接受

　　二、HPLC法的局限性

　　重要事項

　　➤專屬性化合物實驗

　　➤使用有機溶劑

　　➤基于化合物的下限計算

　　➤有限的化合物溶出度

　　➤有用終產品的放行

　　致命的缺點

　　➤HPLC靈敏度的局限性

　　➤每一個驗證都必須有單獨的SOP

　　➤很長的啟動時間

　　➤長的樣品分析時間

　　➤對CV來說，許多的功能不需要

　　➤要處理新的未知峰

　　Example：

　　在標準品出峰位置沒有出峰。

　　通過清潔驗證，沒有問題!

　　1、出峰位置異常;

　　2、出現異常未知峰;

　　不能通過清潔驗證，同時 FDA要求確認未知峰!確認工作繁瑣。

　　三、TOC替代HPLC

　　➤HPLC比較難于使用且必須驗證每一個有機化合物

　　➤無未知HPLC峰時才沒有問題

　　➤TOC易于驗證

　　➤TOC可用于設備刮擦后或用于終的漂洗水

　　➤TOC基于“壞情形下的TOC下限”

　　➤等于目標化合物用碳計量的上限濃度(不等于化合物)

　　➤所有有機污染物的總和必須小于下限

　　(清潔驗證中HPLC到TOC探測的轉化，非常容易做到)

　　➤轉換HPLC下限中已確定的目標化合物濃度的總有機碳的總和。

　　➤如果必須，調整清潔程序，以TOC低于TOC下限。

　　四、TOC法的優勢

　　意味著將有機物作為專屬物質，不管其來源(包括產品、清潔劑、化學品、溶劑、副產物及微生物污染)，要判斷出任何殘留物質是否存在，采用TOC分析能夠地很好完成這一任務，只要其分子結構中包含碳，就能夠檢測出任何的活性制藥成分或者清潔用的殘留物質。而檢測結果必須低于目標化合物物的限度，提高了清潔驗證的嚴格性。

　　五、TOC來檢測法規上的支持

　　➤ “然而, 不像終產品的殘留物, 在清洗后我們期望無任何(或對非常敏感的分析來說非常低)清潔劑殘留。”

　　FDA Guide to Inspections of Validation of CleaningProcesses

　　➤FDA在檢測污染物殘留的規章指南中，已經接受了TOC方法。

　　➤PDA技術報告29號和 49號的附錄提到在新清潔過程中采用 TOC 方法并取代專屬性方法

　　本文件采用的壞情況方法專注于清潔過程結束時可能存在的殘余物(清潔劑)。但常見的做法是使用工藝中的污漬，或類似藥品或感興趣的化合物的替代品。

　　強烈在清潔驗證中采用TOC分析：

　　◀相對較低的初期投資以及很低的操作和維護的費用

　　◀使用方便，易于培訓新使用者

　　◀*的靈敏度，能夠執行低濃度的檢測，相比于其它的方法成本極低并且能夠檢測所有含碳類的殘留物質

　　◀快速的分析時間。

　　◀干擾極小

　　◀提高設備周轉時間。

　　第三章TOC分析方法的驗證

　　一、分析方法驗證的要求

　　分析方法學驗證包括線性、檢測限( MD )、定量限 (COG)、度、度以及擦拭回收率。

　　Refrence:USP<1226>and ICHQ2(R1)

　　➜只有在分析方法是可靠的和可重復的時，驗證才可通過。

　　➜USP<1226>與ICH Q2(R1)闡述了分析方法的驗證程序。

　　二、TOC分析方法驗證的前提：TOC分析儀的性能確認

　　➤分析儀器確認是一個過程，確保對特定測試使用分析方法是能符合目標用途的。

　　➤根據cGMP規定，“企業所使用的檢測方法的度、靈敏度(檢測限)、專屬性和重現性(度)必須確立并有文件證明。”在這種情況下用TOC法進行清潔過程驗證的測試之前，對分析儀器進行嚴格的確認就尤為重要。此方法包括由USP<1058>所建議的安裝確認、運行確認和性能確認(IQ/OQ/PQ)。

　　《中國藥典》(2015版)四部 0682 制藥用水中總有機碳測定法

　　三、系統適用性試驗

　　要求：響應效率應為85%～115%。

　　試劑：

　　➜蔗糖標準溶液(含碳量0.500mg/L)

　　➜1，4-對苯醌標準溶液(含碳量0.500mg/L)

　　四、分析方法驗證的要點

　　➤專屬性(%碳)

　　➤線性度：5點

　　➤范圍：高和低之間的濃度覆蓋域

　　➤度：(總有機碳)

　　➤度：%RSD百分標準偏差

　　➤低檢測限(LOD)、低定量限(LOQ)

　　➤可靠性：在不同的使用條件

　　五、TOC方法驗證的具體內容

　　➤專屬性

　　專屬性：專屬性是能能非常地確定所存被測物質。ICH Q2(R1)如能對目標物質進行的定量檢測，有機碳，就顯示出這分析方法對有機碳具有專屬性。這可通過檢測具有代表性的一些有機——可選一些含有除碳、氫、氧以外元素的有機物，比如含有氯、硫、氮或磷的有機物

　　Example：FDA缺陷例子

　　“Your firm failed to establish and follow writtenprocedures to assure the cleaning and maintenance of equipment used in themanufacturing of drug products. Forexample, cleaning validation for the CIP process vessel, which is utilized inthe aseptic formulation of the CIP process vessel, which is utilized in theaseptic formulation of trivalent bulk influenza vaccine… The study did notinclude swab sampling of the product transfer lines.”

　　貴司未能建立和遵循已寫的操作規程，在藥品制造中確保清潔和維護設備。例如，流感疫苗的CIP過程罐清潔驗證未包括對生產線的棉簽取樣實驗。

　　➤線性和范圍

　　線性：是指測定結果與試樣中被測物濃度呈正比關系的程度。

　　范圍：是指能達到一定精密度、度和線性，測試方法適用的高低限濃度或量的區間。

　　➜定量檢查應至少測試5個濃度范圍并且包含清潔的低限和高限度。

　　➜線性的相關系數應不低于0.98%。

　　➜濃度范圍應達到殘留物限度的50%-150%。

　　➜淋洗法和棉簽法用于限度檢查時不需做線性/范圍驗證。

　　Example：TOC測量值和目標物濃度的相關性

　　參考文獻：《藥物分析雜志》 2013.33.(3)

　　➤精密度和度

　　要顯示TOC法的精密度和度，以含10-6碳的標準品溶液連續檢測10次。這里選用此碳濃度來評估精密度和度是因為通常殘留物的 TOC限度一般為此水平左右。在此 TOC水平，精密度為 1%，度為±5%。

　　➤回收率試驗

　　確定合適取樣方法(沖洗方法、擦拭方法、取樣人員的操作培訓及檢測方法)可使污染物/殘留被有效收回，終為驗證方法提供證據。

　　通過回收率試驗驗證取樣過程的回收率和重現性。

　　通常取樣回收率和檢驗方法回收率結合進行。

　　Ø 取樣方法

　　方法

　　擦拭法

　　淋洗法

　　定義

　　在探針的一端裝上一種惰性材料(通常用原棉或類似的材料)，用它系統的交叉摩擦表面。

　　取淋洗線路的下游的排水口。

　　優點

　　Ø 可以評估難以清洗和相當容易接近的區域，使得可確定每個給出的表面區域的污染物或殘留物的級別。

　　Ø 不能溶解的殘留物可以通過物理切除的方法來取樣。

　　Ø 大面積的取樣。

　　Ø 可以對人為達不到或常規不能卸解的系統進行取樣和評估。

　　缺點

　　Ø 不易在大型設備上實施。

　　Ø 從小面積獲得的結果外推至設備的整個產品接觸表面。

　　Ø 不易對難接近的區域進行取樣。

　　Ø 殘留物或污染物可能不溶解或堵塞在設備中。

　　Ø 受被取樣物溶解性的影響。

　　Ø 只是簡單檢測沖洗水的質量(它是否符合測試綱要)而不檢測潛在的污染物的做法是不被認可的。

　　Ø 擦拭法回收率

　　可接受標準 回收率：≥50%

　　重現性：≤20%

　　步驟舉例：

　　1、準備1塊500 mm ×500 mm的平整光潔的不銹鋼板。

　　2、在鋼板上用鋼錐劃出400 mm ×400 mm的區域每隔100 mm劃線形成16塊100 mm ×100mm的方塊。

　　3、配制濃度為160 mg/L的妥布霉素水溶液定量裝入噴霧器。

　　4、將約10 mL溶液盡量均勻地噴在400 mm ×400 mm的區域內。

　　5、根據實際噴出的溶液量計算單位面積上的妥布霉素量約1μg/100mm2。

　　1

　　2

　　3

　　4

　　5

　　6

　　7

　　8

　　6、自然干燥或用電吹風溫和地吹干不銹鋼板。

　　7、用注射用水潤濕棉簽按擦拭取樣操作規程擦拭鋼板每擦一個方塊，100 cm2換一根棉簽。在鋼板上取均布的8個方塊。

　　8、將棉簽分別放入試管中定量加入注射用水10 mL，加塞輕搖試管并放置10 min，使物質溶出。然后將溶液稀釋10倍。

　　9、使用TOC分析儀測定此清潔驗證水樣的TOC值。

　　10、計算回收率。

　　擦拭回收率(%)=0.8914/1×100%=89.1%

　　帶入校正公式 實際計算值

　　結論：的回收率，說明TOC分析方法適合目標化合物擦拭法的清潔驗證檢測。

　　Ø 擦拭技術

　　注意：連貫性，固定的力度、速度和線路。

　　Ø 淋洗法回收率

　　通常淋洗法限度檢查不需做回收率驗證，定量檢查應做回收率驗證。可以利用淋洗溶劑沖洗已知量(在限度附近)的分析物確定回收率，回收率通常應不低于95%。

　　淋洗法樣品可dui沖洗液直接檢測，也可dui沖洗液做稀釋后檢測，無論直接檢測還是稀釋檢測都應在接到樣品后首先將樣品同溶劑做視覺檢查確定是否有顏色差異和異物存在，如果有述現象發生，可直接判定樣品不合格。

　　Ø 回收率接受程度

　　測試結果

　　評價

　　>80%

　　1. 可接受

　　2. 良好的樣品采集方法

　　>50%

　　1. 理論上可接受

　　2. 需要評價是否可以提高

　　<50%

　　1. 不合格

　　2. 而且需要調查

　　➤低檢測限(LOD)、低定量限(LOQ)

　　LOD/LOQ推演法

　　記錄低濃度純屬標樣的實測TOC值和標準偏差(用250、500、750ppbTOC的蔗糖)

　　使用小二乘線性回歸算法，確定標樣的標準差比實測濃度的方程;確定Y軸為標準偏差，X軸為深度。

　　根據回歸分析確定該行的Y軸截距

　　Y軸截距代表零分析物濃度時的標準偽善(Y軸截距=│S0│)

　　計算檢測限(LOD=│Y軸截距│×3)

　　計算檢測限(LOQ=│Y軸截距│×10)

　　參考文獻：Taylor,John K,Quality Assurance of Chemical Measurement(化學測量的質量) Lewis Publishers imprint of CRC press(1987)

　　六、TOC分析方法的注意點

　　➜使用校準曲線，即TOC和目標物濃度的線性相關性是否良好。因為每一有機物的氧化效率是不同的。(除非氧化效率高，可以忽略)

　　➜擦拭法需要同時對照溶劑(如注射用水)和棉簽，即擦拭coupons，進行TOC分析，來判定干擾程度。

　　➜必須選擇原理、量程合適的TOC分析儀。因為清潔驗證的水樣與注射用水不同，無法預測水樣的清潔程度。